Отбор материала для патоморфологического исследования. Путь к успешному лечению животного с опухолевым процессом начинается с диагностики патологического очага на макроскопическом уровне. Следующий шаг – это дифференциальная диагностика патологического процесса при помощи микроскопии (воспаления, гиперплазии, неоплазии или же сочетания этих процессов).
ВНИМАНИЕ: Отбор материала для патоморфологического исследования должен проводиться только ветеринарным специалистом с учетом локализации, клинико-морфологических особенностей образования и анатомического строения области интереса взятия пункции.
Морфологический метод анализа клеточного состава патологических процессов. Является быстрым, недорогим и малоинвазивным методом по сравнению с гистологией.
Имеет преимущество перед гистологическим при оценке процессов в случае инфицирования бактериальными и грибковыми агентами.
Позволяет более детально рассмотреть отдельные структуры клеток.
Отсутствие данных об архитектонике исследуемой ткани (то есть невозможности оценки инвазии, что важно для определения злокачественности и прогноза заболевания)
Малое количество материала, на основании которого не всегда можно четко сформулировать заключение. Отсутствие возможности дифференцировать пролиферативные, дистрофические, предопухолевые процессы и доброкачественные опухоли.
Зависимость качества материала от техники забора и места отбора пункции (при небольших очагах может быть не информативным)
Тонкоигольная биопсия
Является удобной техникой исследования образования мягких тканей (кожные поражения, лимфоузлы, образования брюшной и грудной полости) и выпотов из полостей тела.
Важно: для взятия биопсии иглу вводят именно через опухолевую зону, избегая прокола «здоровых» тканей для предотвращения диссеминации опухолевого процесса. В дальнейшем, при операционном лечении, место пункции удаляется вместе с тканью опухоли.
Оборудование для проведения исследования:
- Сухие стерильные предметные стекла
- Шприцы на 5 (2/10/20 мл). Шприцы на 10/20 мл удобнее использовать для аспирации из плотных образований.
- Иглы 20 -27 G
- Карандаш (для стекол с матовым концом) или спиртоустойчивый маркер.
- Пробирки для отбора жидкостей без наполнителя и с антикоагулянтом.
ВАЖНО: проба, отобранная в пробирку с ЭДТА не пригодна для микробиологического исследования вследствие бактериостатического действия антикоагулянта. - Емкости для хранения, транспортировки цитологических образцов.
В идеале делается несколько мазков из одного или двух мест новообразования в зависимости от размера.
Для таких органов, как печень и селезенка, необходимо использовать более длинные иглы, особенно для крупных пород собак.
Спинальные иглы со стилетом рекомендованы для того, чтобы избежать контаминации клетками прилегающих тканей.
Материал может быть получен «аспирационными» и не аспирационными методами.
Не аспирационная техника предпочтительна для взятия всех обильно васкуляризированных образований или органов (печень/селезенка), для того чтобы минимизировать контаминацию периферической кровью.
Не аспирационная техника отбора материала (ТИБ)
Подходит для отбора проб при кожных поражениях. Данный метод позволяет лучше сохранить морфологию хрупких клеток и сводит к минимуму контаминацию образца.
Может давать недостаточное количество клеток в материале из слабо эксфолиативных масс.
1 вариант: Использование только иглы
- Игла без шприца вводится в поражение после обработки кожи.
- Затем иглу вводят поступательными движениями вперед -назад в ткани около 10 раз и извлекают.
- Прикрепляют шприц, заполненный 3-5 мл воздуха и быстро и осторожно выдавливают клетки на предметное стекло.
2 вариант: использование иглы с прикрепленным шприцем:
- Предварительно заполненным 3-5 мл воздуха. Игла со шприцем вводится в ткани поступательными движениями вперед – назад (в пределах одного прокола).
- После извлечения из тканей материал наносится на стекла и сразу же готовится мазок .
Аспирационная техника (ТИАБ)
Подходит для отбора проб при большинстве поражений кожи (невозможность взятия соскоба (например, мезенхимальные пролиферации).
Чрезмерное отрицательное давление, возникающее при применении данного метода, может привести к повреждению клеток, преимущественно, таких хрупких, как лимфатические. Так же возможна чрезмерная гемодилюция образца.
- Перед проведением процедуры, кожа на месте взятия материала дезинфицируется как перед проведением венепункции.
- Образование/орган фиксируются в одной руке, а другой вводится игла, прикрепленная к шприцу.
- Далее поршень шприца оттягивают, создавая отрицательное давление, одновременно двигая иглу в разных направлениях внутри области интереса.
- Иглу с прикрепленным шприцем извлекают после отпускания поршня.
- Шприц наполняют 3-5 мл воздуха и снова прикрепляют к игле, и осторожно выдавливают содержимое на предметное стекло.
Примечания:
- возможно использование коммерческих аспирационных пистолетов при аспирации из н/о или органов, которые сложно иммобилизировать. При их использовании нет необходимости тянуть за поршень шприца, вакуум можно легко сделать одной рукой.
- рекомендовано проводить ТИАБ органов и образований брюшной полости под контролем УЗИ.
Техники изготовления цитологических препаратов
При изготовлении мазков следует избегать избыточного сдавливания. Для приготовления цитологических мазков можно использовать метод «мазка крови» и методом «сквош» (компрессионной капли).
Метод мазка крови: подходит для любых жидких образцов.
- Каплю образца помещают на предметное стекло, близко к окошку для маркировки.
- Конец второго стекла (шпателя) помещают перед каплей под углом в 30 градусов в среднем и сдвигают аккуратно, пока оно не коснется нанесенной капли образца.
- После контакта с образцом каплю медленно растягивают по всему предметному стеклу. Мазок растягивают, создавая препарат с толстым и тонким краем (с зоной монослоя и «щеточкой»). Следует учитывать, что чем более жидкой образец, тем угол более тупой; если же образец вязкий, то угол нужно делать острее.
Метод «сквош»: подходит для большинства цитологических образцов.
- Материал, полученный путем тонкоигольной биопсии, наносится на сухое чистое предметное стекло.
- Второе предметное стекло помещают сверху первого (перпендикулярно), слегка соединяя стекла для равномерного распределения материала, стекла медленно раздвигают в разные стороны в результате чего клетки равномерно распределяются на оба стекла.
При изготовлении препаратов таким способом следуем соблюдать осторожность, не оказывая чрезмерного давления, которое может привести к повреждению клеток. Образцы материала не должны выходить за край мазка.
Мазки – отпечатки
Подходит для взятия клеток непосредственно с поверхности области интереса (со среза удаленного образования, с области влажных язвенных, тонких экссудативных поражений). Применяется если невозможно выполнить тонкоигольную аспирацию.
Полученный образец является информативным только для верхней части поражения, клетки в препарате могут не демонстрировать патологии в более глубоких слоев. Так же вероятна бактериальная контаминация.
Аккуратно промокнуть интересующую часть поражения стерильной марлей, удаляя кровь и тканевые жидкости. Наложить предметное стекло на поражение .
Забор материала и приготовление мазков при помощи тампона.
Подходит для оценки полостей, синусовых путей и поражений с дренажом (примеры: ушная раковина, вагинальная цитология).
Ватный тампон, пропитанный физиологическим раствором, вводят в раневой канал или очаг поражения с дренажом. После извлечения аккуратно прокатывают по предметному стеклу, делая несколько продольных мазков.
Цитологические мазки сушат только на воздухе.
Они не должны подвергаться действию паров формалина и повышенной влажности.
Если мазки отправляются в диагностическую лабораторию, то самостоятельное окрашивание не рекомендуется.
Нельзя склеивать мазки, сушить мазки при помощи зажигалки или фена, фиксировать мазки в спирте до полного высыхания.
Факторы, способные оказать влияние на информативность цитологических образцов:
- Некорректная техника отбора проб или неверное распределение образца по предметному стеклу;
- Чрезмерная аспирация
- Повреждение клеток при их распределении по предметному стеклу.
- Геморрагические поражения
- Аспирация из очага некроза
- Эксфолиативный материал (а также, поражения богатые коллагеном стромы).
- Сложности связанные со спецификой окрашивания
- Недостаточное окрашивание, связанное с неправильным протоколом окраски или контаминация материала с предыдущим окрашиванием.
- Загрязнение образца смазкой или ультразвуковым гелем.
- Воздействие паров формалина на нефиксированные предметные стекла.
Когда в образце мало клеток или образец содержит преимущественно разрушенные клетки, не имеющих четких границ цитоплазмы, цитологическая интерпретация невозможна и рекомендован повторный отбор проб.
Аналогично если клеток в мазке много, и они расположены плотными слоями, не позволяющими визуализировать морфологические особенности клеточной популяции, сделать корректное цитологическое заключение не представляется возможным.
Так же если в образце достаточно клеток, они не подвергались внешнему воздействию, но качество окрашивания низкое и не представляется возможности его улучшить, цитологический диагноз должен быть исключен.
Список использованной литературы:
- Атлас опухолей собак и кошек. Интерпретация и диагностика. Киль А., Кальдервуд Мейс М. М.- издательство «Аквариум» 2018, 220с.
- Ветеринарная лабораторная медицина. Интерпретация и диагностика. Денни Мейер, Джон Харви. Перевод с англ.-М.: «Софион» 2007, 456с.
- Ветеринарная клиническая патология. Введение в курс. Под общей редакцией М.Джексона/.-М.: «Аквариум»
- Цитологические исследования у собак и кошек. Справочное руководство/ под общей редакцией Дж.Данна /Пер. с англ. Е.Поляковой.- М.: «Аквариум Принт», 2016, 256с.
- Цитология. Дифференциальная диагностика новообразований кожи и мягких тканей у мелких домашних животных. Франческо Чиан, Паола Монти /Пер. и научная редакция М.А.Оксюкевич, А.А. Добычина, Т.В. Андреева, Р.А.Суханов, А.А.Газин, А.С.Чобода — Издательский дом «НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА», 2021, 230с.